TB基因分型試劑盒 VNTR-9
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k2571
TB 基因分型試劑盒 HV-3
產品簡介
本試劑盒是以分子流行病學新一代研究進展
1）
為基礎，經工藝優化后形成的人型結核分枝桿菌基因分型產品。本產品利用
結核分枝桿菌基因組中可變數目串聯重復序列（variable-number tandem repeats, VNTR）多態性進行基因型分型區分臨
床菌株，是研究結核分枝桿菌分子流行病學和監測結核病傳播狀況的有力工具。與現有其它基于VNTR原理的結核分枝桿菌
VNTR分型系統相比，這一分型系統對中國流行的菌株具有更強的分辨能力1，2，3），因此特別適合于中國用戶的需求。
通過對各PCR反應引物序列和預混反應液成份進行精心優化，使得本產品具有很強的抗干擾力。與用戶自配試劑相比，
本產品顯著提升了特異條帶信號強度，降低了使用粗制模板（煮沸菌液）時非特異條帶的出現率，使實驗操作更加簡便、快
捷的同時，提高了檢測成功率。本產品的預混反應液化學穩定性良好，能有效抵抗反復凍融（10次）和較長時間（一周）
的室溫環境，更好地適應了用戶檢測工作中的靈活性需求。
本產品將人型結核分枝桿菌（MTBC）鑒定、非結核分枝桿菌（MOTT）及模板質量鑒定、結核分枝桿菌北京家族菌株
鑒定，和后續的9位點VNTR分型鑒定整合在一個試劑盒中，使用戶僅需一個試劑盒、12個PCR反應即可獲得待測菌株基因
型鑒定所需的完整信息。檢測的分辨力指數（Hunter-Gaston index，HGI）可達0.989 。并且，基因型鑒定結果可數字
化記錄，使得不同樣本批次，不同地區，不同時間，不同研究者之間的實驗數據可以很方便地進行比對和匯集分析，
提高了數據的使用效率。
對鑒定為VNTR-9基因型成簇（所有9個位點具有相同重復數）的樣本，若要判定菌株間是否存在近期傳播關系，需使用
配套產品TB基因分型試劑盒HV-3（貨號K2571），做進一步的分型鑒定。VNTR-9與HV-3兩個產品的結合使用可將檢測
的HGI提升至0.993 。關于TB基因分型試劑盒HV-3（貨號K2571）產品的更多信息請見其產品說明書。
1）
參考文獻
1） Luo T et al. Development of a hierarchical variable-number tandem repeat typing scheme for Mycobacterium
tuberculosis in China. PLoS One. 2014 Feb 25;9(2)
2） Sun G et al. Discriminatory potential of a novel set of Variable Number of Tandem Repeats for genotyping
Mycobacterium marinum. Vet Microbiol. 2011 Aug 26;152(1-2)
3） Zhang L et al. Highly polymorphic variable-number tandem repeats loci for differentiating Beijing genotype
strains of Mycobacterium tuberculosis in Shanghai, China. FEMS Microbiol Lett. 2008 May;282(1):22-31.
注意事項
1.為避免污染，建議制備樣本和配制 PCR Mix 在不同的地點內進行，并使用不同的移液器。
2.在樣本 DNA 的收集，抽提和擴增的所有環節都應注意作好標記，同時防止不同樣本間發生交叉污染。
3.常用試劑和耗材在實驗前需高壓滅菌。
4.每管 PCR Mix 中均含有不同的引物，不可混用。可根據實驗需求一次性分裝為不同的量，避免反復凍融。
5.為避免打開反應管時，反應液飛濺，開蓋前請短暫離心，收集液體于管底。若不小心濺到手套或桌面上，應立刻更換手
套并用 75%酒精或稀酸擦拭桌面。
6.吸取時注意不要交叉污染 PCR Mix，建議每次取 Mix 前用 75%酒精擦拭移液器頭 2 次。
7.
實驗前準備：1×TE 緩沖液（PH=8.0）、0.5×TBE 緩沖液、瓊脂糖、溴化乙錠（EB）、普通 PCR 儀、DNA 電泳設備和
凝膠成像儀、0.2 ml PCR 反應管、八聯排或 96 孔 PCR 管、不同規格的移液器：0.5-10 μl 和 20-200 μl。
操作步驟
1.
DNA 模板制備：
1.1 從固體培養基上刮取少量（1-2 接種環）樣本，重懸于 100 μl TE 中，80°C 滅活 30 分鐘。
1.2 滅活后的菌株拿出 P3 實驗室進行如下操作：
100°C 煮沸 10 分鐘（煮沸時 EP 管蓋子可能會爆開，要盡量避免，扣緊 EP 管，不要讓水進入管中），立即置于冰上 2
分鐘，12,000 rpm（~13,400×g）離心 10 分鐘后，取上清置于另一無菌 EP 管中，做上標記，-20°C 保存。
2.
檢測程序：
2.1 取出 TB 基因分型試劑盒 VNTR-9，待液體平衡到室溫后，輕微搖晃 3-4 次混勻，12,000 rpm 離心 5 秒，使蓋上的
液體收集到管內。
2.2 結核分枝桿菌基因型分析：
2.2.1 鑒定樣本是否為人型結核分枝桿菌（重要！此步驟不可省略！）：
A．PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl Mtb 鑒定 PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。
B．反應程序：
C.
制膠，電泳
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×6 cm 膠盤制膠，每塊膠為 40 ml。
1）稱取 0.4 g 瓊脂糖，加入 40 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖
勻，觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠凝膠的濃度不受影響。
2）待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 2 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將
溫熱的凝膠澆灌入膠盤。
3）待凝膠*凝結（室溫下放置 30 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，
沒過膠面 1-2 mm。
4）PCR 產物上樣：每個孔中加入 3 μl PCR 產物，每塊膠上留一個孔加入 5 μl MarkerⅠ，每塊膠上加一個 H37Rv 作
為質量控制。電壓 150V，電泳時間為 45 分鐘。
結果顯示：
D．結果分析：
1）如果出現了 850 和 361 bp 兩條帶，則說明模板 DNA 是人型結核分枝桿菌，可進入第 F 步（見后面）進行結核分枝桿
菌北京基因型的分析鑒定，并進一步使用本試劑盒對該菌株進行 9 位點 VNTR 基因型分析鑒定。
2）如果只擴增出 850 bp 的條帶，則說明該菌株屬于結核分枝桿菌復合群，但不是人型結核分枝桿菌，不適用本產品進行
基因型分析鑒定。
4）如果沒有特異性條帶擴增，則說明該菌株是非結核分枝桿菌或模板 DNA 質量不好，不適用本產品進行基因型分析鑒定，
可放棄該樣本，或進入第 E 步（見后面），檢測 DNA 模板的質量。
E．DNA 模板質量鑒定：
若在以上步驟 A-D 中沒有特異性條帶擴增，則說明模板 DNA 質量不佳或該菌株并非結核分枝桿菌，出現此種情況請
進行如下操作。
1）PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl 16S rRNA PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。
2）反應程序：
3）電泳
1%瓊脂糖凝膠電泳，150V 電泳 45 分鐘；
4）結果顯示：
5）結果分析：
所有細菌中都存在 16S rRNA 序列，如果樣本無擴增產物，說明模板 DNA 的數量或質量不足以進行 VNTR 基因分型
檢測。如果有擴增產物條帶出現，則說明此菌株為非結核分枝桿菌，不應使用本試劑盒進行基因分型鑒定。
F．北京基因型菌株鑒定方法：
在確定菌株為結核分枝桿菌后，進一步區分是否屬于北京基因型菌株。
1）PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
在每個 PCR 管中分別加入 19 μl RD105 PCR Mix，1 μl DNA 模板，混勻。
2）反應程序：
3）電泳
1%瓊脂糖凝膠電泳，150V 電泳 45 分鐘。
4）結果顯示：
5）結果分析：
如果擴增產物為 1495 bp，該菌株為非北京基因型菌株；
如果擴增產物為 786 bp，該菌株為北京基因型菌株。
2.2.2 結核分枝桿菌 9 位點 VNTR 基因型分型法：對結核分枝桿菌臨床菌株進行基因型分析，初步鑒定成簇菌株。
A．PCR 擴增：反應體系為 20 μl。
取 9 個 PCR 反應管，在每個 PCR 管中分別加入 19 μl QUB-11b，QUB-18，QUB-26，MIRU26，MIRU31，MIRU40，
Mtub21，Mtub04，VNTR2372 的 PCR Mix，加入 1 μl DNA 模板，混勻。
B . 反應程序：
C. 制膠、電泳：
C-1：注意事項：
重要！每次實驗需要設置陽性（H37Rv 菌株 DNA）和陰性對照（去離子水）。
關鍵！本實驗是以瓊脂糖凝膠電泳為基礎來判讀 VNTR 位點基因型，因此，為了使不同實驗室結果能準確的相互比較，
在電泳這一步必須要按照統一的標準操作，應注意以下幾點：
1） 制膠所用梳子為 18 孔。
2） 凝膠左右邊上的兩個孔由于在電泳過程中容易使條帶變形，影響結果判讀，舍棄不用，或者在其中一個孔點上陰性對
照，剩余 16 孔分為 12 個樣本，3 個 DNA Marker 和 1 個陽性對照。點樣順序分別為“1，2，M，3，4，5，6，M，
7，8，9，10，M，11，12，H37Rv”，數字代表樣本，M 代表 DNA Marker。
3） PCR 擴增產物進行首ci電泳并使用 Marker I 時，凝膠濃度為 1%，應使用兩電極間距離不小于 30 厘米的電泳槽，電
壓為 150V，時間為 100-120 分鐘。
4） 如果擴增產物片段過大（>1000bp），需要再次電泳并使用 Marker II 時，凝膠濃度為 0.8%，應使用兩電極間距離不
小于 30 厘米的電泳槽，電壓 150V，時間為 150 分鐘。
C-2：制膠以及電泳過程：
使用 1%的瓊脂糖凝膠對 PCR 擴增產物進行電泳。
配制 1%的瓊脂糖凝膠，12×12 cm 膠盤制膠，每塊膠為 80 ml。
1）稱取 0.8 g 瓊脂糖，加入 80 ml 0.5×TBE，在天平上稱重后放入微波爐，高火加熱 2-3 分鐘，使瓊脂糖*溶化，搖勻，
觀察為均一透明溶液，無顆粒，再在天平稱量，補入適量的雙蒸水，以保持膠的濃度不受影響。
2）待融化的凝膠冷卻至 55℃左右時加入 4 μl 溴化乙錠（10 ug/ml），輕輕旋轉以充分混勻。用 18 齒的梳子制膠，將溫
熱的凝膠澆灌入 12×12 cm 膠盤。
3）待凝膠*凝結（室溫下放置 40 分鐘），小心拔出梳子，取出托盤，放入電泳槽中。電泳槽中加入 0.5×TBE 緩沖液，
沒過膠面 1-2 mm。
4）上樣電泳：每塊膠中加入 12 個樣本（最邊上的孔不加樣），每個孔中加入 3-5 μl PCR 產物，同時每塊膠上加三個 5 μl
DNA MarkerⅠ，加一個 H37Rv 作為質量控制（點樣孔分布見下圖）。電壓 150V，電泳時間為 100-120 分鐘。本步驟
是各位點最終讀數是否準確的關鍵，需要統一按照此標準操作。
5）部分位點（QUB-18 及 QUB-26）在臨床菌株中存在擴增產物大于 1000 bp 的情況，對這些擴增產物再利用 0.8%瓊脂
糖凝膠進行電泳，同時加入 DNA MarkerⅡ 作為條帶大小對照，電壓 150V，電泳時間 150 分鐘。
MarkerⅠ
MarkerⅡ
D. 結果分析：
根據各臨床菌株擴增條帶與 Marker 相對位置，利用凝膠分析軟件讀出每個條帶的大小。利用各 VNTR 位點重復單元讀
數表及 VNTR 位點讀數規則，計算出各菌株在該位點的重復單元數，每個 VNTR 位點重復單元讀書表及 VNTR 位點讀數規
則附后。
結果報告： Excel 文件（以下表格為結果報告輸出格式舉例）
比較不同菌株 9 個 VNTR 位點的重復數，進行成簇分析：如果兩個或兩個以上菌株具有相同 9 位點基因型，則初步鑒
定為成簇菌株，如有必要，可使用配套產品，K2571， TB 基因分型試劑盒 HV-3，做更精細的進一步分型鑒定。如果
分離的菌株具有特異的 9 位點基因型，則鑒定為單一菌株。
附錄 1：VNTR 位點讀數規則
附錄 2 ：VNTR 位點重復單元讀數表
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